Cultura de meristeme apicale la viţa-de-vie

Cunoaşterea evoluţiei diferitelor părţi ale plantei în cursul dezvoltării sale, oferă, după cum prezintă E. Vişoiu şi colaboratorii, posibilitatea unei mai bune utilizări a capacităţii de regenerare, în cazul multiplicării in vitro. Dezvoltarea morfologică a părţii caulinare a unei plante decurge din activitatea organogenă acropetă a unui mic grup de celule meristematice situat în poziţie apicală.

Acest punct vegetativ posedă o activitate mitotică ridicată, asigurând o creştere nedefinită, fără a evolua în organe reproducătoare. Inducerea proceselor de regenerare in vitro şi multiplicarea vegetativă depind în mare măsură de cunoaşterea mecanismelor de funcţionare a meristemelor caulinare.

Factorii care influenţează capacitatea regenerativă a meristemului aplicat în cultura in vitro la viţa-de-vie

Exprimarea capacităţii regenerative a explantelor condiţionată atât de factorii biotici, cât şi de factorii abiotici este o realitate în general acceptată. Inoculul constituie o unitate vie, independentă de locul de origine, care deţine integral informaţia genetică preluată de la planta donatoare, precum şi toate funcţiunile pe care le îndeplinesc ţesuturile la locul de origine. De regulă, cu cât nivelul de organizare al inoculului este mai simplu, cu atât necesităţile nutriţionale şi cele privind condiţiile de cultură sunt mai pretenţioase, iar substratul nutritiv trebuie să fie mai complex şi să conţină o gamă mai largă de substanţe organice. Prin urmare, este posibilă regenerarea plantelor de viţă-de-vie aparţinând unor genotipuri foarte diferite, prin aplicarea aceluiaşi protocol de lucru, ba chiar mai mult, este posibilă realizarea etapei de multiplicare pe acelaşi mediu utilizat în faza de iniţiere (organogeneză). Totuşi, cel mai adesea, protocoalele de regenerare din meristem apical la viţa-de-vie sunt valabile pentru anumite genotipuri şi în condiţii specifice de cultură. În acest context, se apreciază că o bună cunoaştere a factorilor care, secvenţial sau pe toată durata culturii, pot influenţa declanşarea sau desfăşurarea proceselor de organogeneză reprezintă o cerinţă importantă pentru aplicaţiile practice ale tehnicilor de regenerare in vitro de plante la speciile Vitis.

Factori biotici

Dacă ţinem cont de primele rezultate obţinute la viţa-de-vie, pornind de la meristeme apicale (Morel şi Martin), putem spune că în circa 48 de ani această tehnică a atras cât mai mult atenţia cercetătorilor şi a practicienilor, calificându-se în multe cazuri drept mijloc sigur de înmulţire. Numeroşi autori au semnalat însă pe parcursul cercetărilor dependenţa foarte strânsă a capacităţii de regenerare de plante pornind de la explante meristematice, faţă de genotip.

Astfel, au fost descrise metode de regenerare pornind de la apexuri meristematice întregi sau fragmentate, cu specific pentru anumite genotipuri, existând reţineri privind generalizarea acestora la întregul gen Vitis. Rezultatele obţinute de diferiţi autori în ceea ce priveşte capacitatea de regenerare a unor specii şi soiuri de Vitis sunt adesea aparent contradictorii. De cele mai multe ori, reactivitatea diferită a plantelor a fost corelată cu potenţialul regenerativ nativ al genotipurilor studiate şi mai puţin cu alţi factori fiziologici (dimensiunea explantului, momentul recoltării etc.). Un exemplu elocvent îl constituie investigaţiile întreprinse de Mirancea şi colaboratorii asupra capacităţii de regenerare a mai multor soiuri de Vitis vinifera, în scopul de a identifica genotipuri cu potenţial regenerativ in vitro ridicat. Referindu-se la numărul mediu de lăstari detaşaţi de pe un meristem într-un ciclu de experimentare (6-8 luni), s-a apreciat superioritatea soiurilor Cabernet Saugvignon şi Tiesling, care au realizat peste 250 de lăstari. Este, de asemenea, interesant de menţionat faptul că în urma comparării speciilor Vitis vinifera şi Vitis cinerea, Vitis labrusca şi Vitis argentifolia, Cher şi Pool au ajuns la concluzia că soiurile ce aparţin speciei Vitis vinifera au o capacitate regenerativă mult mai mare (75%) decât celelalte specii (5-50%). De altfel, în ansamblul său acest experiment a demonstrat că influenţa genotipului se reflectă nu numai prin capacitatea de regenerare, ci şi prin momentul declanşării lăstăririi multiple după stabilizarea culturii (55 de zile). Se apreciază că prin experimentarea potenţialului regenerativ al meristemelor apicale, care corespunde unui caracter ce urmează modelul eredităţii simple, este necesară şi corelaţia cu starea fiziologică a explantului. Acest factor este considerat critic, deoarece s-a explicat că variaţia în timp a intensităţii procesului de regenerare depinde şi de modificările sezoniere ale concentraţiei regulatorilor de creştere esenţiali (auxine şi citochinine). În acelaşi sens, Clong şi colaboratorii au demonstrat că explantele recoltate de la plantule din in vitro se comportă mult mai bine decât cele excizate de la plante crescute în seră. Rolul important al stării fiziologice a plantelormamă, donatoare de explante, a fost justificat prin rezultatele experimentale obţinute cu diferite genotipuri de viţă-de-vie. De altfel, şi alţi cercetători recomandă recoltarea explantelor de la butaşi fortificaţi în seră (faza de creştere activă) sau de la plantele obţinute de la butaşi fortificaţi în seră (faza de creştere activă) sau de la plantele obţinute prin cultură in vitro a mugurilor axilari.

Factori abiotici

Capacitatea regenerativă  a meristemelor la viţa-de-vie, odată desprinse de planta- mamă, a fost evidenţiată în numeroase studii prin experienţe efectuate în scopul relevării faptului, că aceste explante pot fi utilizate pentru regenerarea unui nou organism. Diferenţierea celulelor merismatice, ca rezultat al multiplicărilor repetate, prin exteriorizarea completă a totipotenţei celulare, este manifestată în funcţie de numeroşi factori endogeni şi exogeni. Analizând ansmblul acestor factori care intervin în exprimarea potenţialului regenerativ al acestor explante, s-a stabilit că realizarea unor amestecuri nutritive care să corespundă necesitaţilor vitale ale ţesuturilor inoculare este indispensabilă. Astfel, mediile sintetice utilizate în cultura in vitro a meristemelor caulinare la viţa-de-vie au fost lichide. La aprecierea rolului şi importanţei diferitelor elemente chimice au existat puncte de vedere variate desprinse din contextul anumitor condiţii de experimentare. Astfel, mediul Murashige Skoog, concept pentru creşterea calusului la tutun, este recomandat şi la viţa-de-vie, deoarece concentraţia ridicată de potasiu stimulează diviziunea celulară. Foarte frecvent, s-au iniţiat culturi de meristeme la unele genotipuri de viţă-de-vie, pe variante de mediu MS, în care s-au redus concentraţiile de macro- şi microelemente, sau chiar au fost excluse unele săruri (Badea şi colaboratorii), obţinându-se totuşi rezultate spectaculoase. Investigaţiile privind rolul îndeplinit de vitamine asupra plantelor s-a dovedit a fi deosebit de important, constatându-se că prezenţa lor este indispensabilă în obţinerea unei creşteri celulare optime. Dacă se are în vedere complexitatea mediilor de cultură şi a condiţiilor în care sunt cultivate explantele, acţiunea vitaminelor se cumulează cu a celorlalte substanţe, exercitând o influenţă sinergică. Unele contradicţii existente în literatura de specialitate, privind utilitatea sau ineficienţa unor vitamine în mediile de cultură specifice meristemelor la viţa-de-vie, au fost înlăturate în urma cercetărilor întreprinse de Gonsales şi colaboratorii. Comparând rezultatele obţinute de aceştia, s-a demonstrat că regenerarea de plante din meristeme este relativ asemănătoare şi în cazul utilizării unor formule ale complexului vitaminic diferite. De regulă, cu cât nivelul de organizare al inoculilor este mai simplu, cu atât necesităţile nutriţionale sunt mai pretenţioase, iar substratul nutritiv trebuie să fie mai complex şi să conţină o gamă mai largă de substanţe organice. S-a demonstrat că potenţialul de regenerare al meristemelor apicale la viţa-de-vie poate fi influenţat în mare măsură de un complex hormonal variat, care compensează lipsa celor mai importanţi compuşi endogeni. Rezultatele experimentale întreprinse în scopul regenerării de plante din meristeme apicale la viţa-de-vie au evidenţiat faptul că aportul exogen al unui complex hormonal (auxine şi citochinine) reprezintă o cerinţă esenţială pentru stimularea proceselor de diferenţiere. Cu toate că modul de acţiune al citochininelor este insuficient elucidat, Houssa şi colabortorii afirmă, prin cercetările întreprinse, că acest grup de regulatori de creştere sunt promotori ai diviziunii celulare din meristeme. Barlass şi Skene au subliniat faptul că proliferarea de muguri adventivi din fragmentele apicale ale lăstarilor de viţă-de-vie este intens stimulată de 6-benzilaminopurina. De asemenea, Pool şi Powel au stabilit că zeatinribozida este cea mai importantă citochinină din exudatul xilemic al viţei-de-vie, care intensifică proliferarea şi elogarea lăstarilor de Vitis labrusca obţinuţi din meristeme aplicale cultivate in vitro. Existenţa în mediul de cultură a benzilaminopurinei în concentraţie de 0,5-2 mg/l şi a zeatinei de 1-5 mg au determinat o creştere moderată a elongării lăstarilor şi o uşoară scădere a fenomenului în cazul combinaţiei de 10 mg/l zeatină şi 0,5-2 mg de benzilaminopurină, în aceleaşi condiţii experimentale. Utilizarea benzilaminopurinei în concentraţii mai ridicate (peste 3 mg) s-a dovedit a avea frecvente efecte nefavorabile, concretizate prin blocarea proceselor de regenerare. Goussard a sesizat efectul inhibitor al benzilaminopurinei (5 mg/l), care nu poate fi compensat de suplimentarea cu zeatină (1-10 mg/l). Deşi s-a raportat că regenerarea din explante meristematice la viţa-de-vie este posibilă în cazul folosirii exclusive a unei citochinine sau a unui complex de citochinine, rezultatele experimentale obţinute de Cheen şi Pool au indicat că răspunsul organogenetic este superior şi în cazul când în mediul de cultură se află şi o auxină (acid b-indolilacetic sau a-naftilacetic). Analiza datelor obţinute la diferite genotipuri de viţă-de-vie indică faptul că regenerarea din meristeme apicale este dependentă de concentraţia de citochinină în mediul de cultură, dar mai ales de raportul citochinină/auxină. Gama concentraţiilor celor două categorii de hormoni este relativ restrânsă, iar eficienţa unei concentraţii sau a raportului citochinină/auxină este influenţată într-o mare măsură şi de genotip în exprimarea potenţialului regenerativ al explantelor. Din categoria factorilor exogeni, care reglează procesele regenerative ale celulelor meristematice inoculate pe medii sintetice, un rol esenţial îl joacă condiţiile de mediu. Deşi în majoritatea condiţiilor de cultură in vitro cerute de experimentele ce au ca scop prioritar regenerarea de plante din meristeme, fotoperiodismul de 16/8 ore (lumină/întuneric) este generalizat, rezultatele unor cercetări au indicat faptul că o perioadă de lumină de 10 ore a favorizat o mai bună proliferare de lăstari la unele genotipuri luate în studiu de Chee şi Pool. Rezultatele experimentale obţinute la un număr variabil de specii şi soiuri ale genului Vitis au arătat că nivelul de temperatură nu influenţează în mod semnificativ evoluţia culturilor de meristem în diferitele etape ale procesului de regenerare.

Victor VĂTĂMANU