Obtinerea materialului saditor viticol din categorii biologice superioare

_Viţa-de-vie, una dintre culturile cele mai răspândite în climatul temperat, este expusă multor factori cu efecte detrimentale asupra producţiei şi aspectului plantelor, datorită interferenţei acestor factori cu procesele fi ziologice de bază. Cauzele unor asemenea efecte adverse pot fi identifi cate ca factori abiotici (regimul climatic, poluarea aerului şi balanţa minerală) sau de natură biotică, dintre care agenţii infecţioşi intracelulari (virusuri, viroizi, procariote asociate fl oemului şi xilemului) au un rol major, cauzând mari pierderi plantelor afectate

---

A. Teodorescu şi colaboratorii consideră că transmiterea virusurilor prin butăşire, altoire şi vectori animali (nematozi, cicade etc.) constitue un pericol major pentru viticultură, stabilirea unei strategii eficace de control şi combatere fiind absolut obligatorie. Există două metode majore care permit regenerarea de plante sănătoase: cultura de meristem şi termoterapia (tratamentul cu temperaturi ridicate). În ambele cazuri, eficacitatea metodei este în corelaţie pozitivă cu tipul tulpinei virale şi genotipul tratat. De asemenea, s-a stabilit o proporţionalitate inversă între dimensiunea explantului şi procentul de devirozare. Datorită utilizării tehnicilor de devirozare pe un număr mare de specii şi soiuri s-a constat că rezultate foarte bune s-au obţinut prin combinarea celor două metode (cultura de meristem şi termoterapia).

Cultura de meristeme, ca metodă de obţinere a clonelor sănătoase
Cultura de meristem, asociată adesea cu aceea de apex meristematic, oferă perspective multiple industriei horticole, în scopul obţinerii de clone sănătoase, plecând de la planta-mamă bolnavă.Primele rezultate ale unei culturi aseptice au fost obţinute de către Kotte (1922) şi Robbins (1922), în acelaşi moment, unul în Germania, celălalt în SUA, prelevând meristeme radiculare de la bob şi de la porumb. La viţa-de-vie, în 1944 (Morel), se înregistrează primele culturi de meristeme, dar abia în 1961, Galzy demonstrează posibilitatea obţinerii de plante libere de virusuri prin cultura de vârfuri de lăstari, corelată cu termoterapia. În practică, procentul de purificare a virusurilor este întotdeauna invers proporţional cu dimensiunile explantului. Într-adevăr, prin microscopie electronică s-a pus în evidenţă prezenţa particulelor virale în celule meristematice, inoculate in vitro, atunci când plantele-mamă au fost bolnave. Mecanismul eradicării virusurilor prin cultura meristematică nu a fost pe deplin elucidat, dar sunt admise diferite ipoteze, cum ar fi: absenţa plasmodesmelor la nivelul celulelor meristematice, competiţia între sinteza nucleoproteinelor necesare diviziunii celulare şi replicarea virală sau intervenţia substanţelor inhibitoare. După unii autori, replicarea virală necesită prezenţa enzimelor normal disponibile în celulele apropiate domului meristematic. Excizia meristemului antrenează un traumatism care redă momentan indisponibilitatea acestor enzime şi deci replicarea virală se întrerupe. ARN-ul viral se degradează şi este integrat în celulă. Astfel, cu cât explantul este mai mic (0,1-0,3 mm), cu atât creşte şansa obţinerii de plante sănătoase. Rezultatele experimentale au confirmat că eliminarea de GFV (virusul scurtnodării) a fost posibilă în proporţie de 54%, iar de closterovirusuri, la 3 genotipuri (Merlot, Trebbiana, Toscana) în proporţie de 73-79%, prin cultura de meristem. Cercetările efectuate în ţara noastră au evidenţiat posibilitatea obţinerii de plante sănătoase prin culturi de meristeme în proporţie de 60-84%, pentru virusul scurtnodării în complex cu virusul fleck şi respectiv 83-95% în cazul virusului răsucirii frunzei, cu condiţia ca explantele să nu fie mai mari de 0,2-0,3 mm. În ultimii ani s-a demonstrat prin protocoalele de lucru că eliminarea răsucirii frunzelor a fost obţinută prin regenerarea in vitro a meristemelor aplicate întregi sau fragmentate. În ciuda succeselor obţinute prin aceste metode, există unele probleme care împiedică utilizarea şi recomandarea acestor tehnici. Una dintre problemele majore o constitue dificultatea izolării meristemelor de dimensiuni cât mai mici (0,1-0,3 mm), urmată apoi de cerinţele multiple necesare pentru asigurarea viabilităţii explantului şi a declanşării proceselor de regenerare. O dovadă în acest sens este experimentul realizat de Gribaudo şi colaboratorii (1997), prin care se realizează un procent de devirozare de 79,3% pentru viruşii cei mai puternici, evidenţiind că rata de eliminare a virusului poate fi influenţată de genotip, de tipul virusului şi, nu în ultimul rând, de dificultatea izolării meristemului.

Termoterapia
Există deja suficiente informaţii care demonstrează că în plantele infectate sistemic de virusuri, titrul virusului descreşte spre meristemul din vârful lăstarului. După confirmarea acestor rezultate de către mulţi cercetători în domeniu, metoda culturilor de apex meristematic şi mugurii axilari s-a extins, adiţionată cu termoterapia, mai ales în cazul closterovirusurilor, unde rezultatele nu erau decât parţial satisfăcătoare. Combinaţia celor două metode a condus la eliminarea virusurilor diferitelor specii de viţă-de-vie. Cercetările întreprinse de Bass şi Legin (1981) susţin şansa vindecării plantelor obţinute prin remultiplicarea lăstarilor după termoterapie, plecând de la explante cât mai apropiate de extremitate. Aceiaşi autori afirmă că procentul de vindecare nu este acelaşi la toate varietăţile; în particular, speciile vinifera şi hibrizii portaltoi americani sunt vindecaţi în proporţie mai mare decât viţele europene Vitis vinifera. De asemenea, se remarcă o diferenţă a eficacităţii tratamentului termic în cadrul speciei vinifera (ex.: soiul Cabernet frank - 70% plante sănătoase, în comparaţie cu soiul Servant - 55%). În experienţele de eliminare prin termoterapie şi cultura de meristem a 4 setipuri de closterovirusuri asociate cu răsucirea frunzei, Stellmach (1993) a evidenţiat că tratamentul termic la 38 de grade Celsius peste 150 de zile şi utilizarea a 3 muguri distali pentru micropropagare asigură o devirozare de 100%. Efectul temperaturii ridicate (36-38 de grade Celsius) aplicată o perioadă îndelungată (60-70 de zile) plantelor infectate donatoare de explante, aparţinând clonei de Vitis vinifera (soiul Rauschling), şi cultivarea in vitro a aplexurilor meristematice au condus la eliminarea totală a closterovirusurilor. Numeroşi specialişti au apreciat că totuşi fitoterapia plantelor-mamă la ghiveci necesită spaţii mari şi sterilizatori de suprafaţă, care pot micşora procentul de regenerare a explantelor. Rezultatele unor cercetări au demonstrat că procente ridicate de plante sănătoase se pot obţine şi prin termoterapia in vitro a explantelor formate dintr-un fragment de un mod. Termoterapia in vitro a explantelor mici (aplexuri de 5 mm) a condus la necrozarea acestora după 8 săptămâni (Leonhardt şi colaboratorii, 1998). Autorii recomandă astfel, pentru eliminarea virusurilor prin termoterapie in vitro, minilăstari înrădăcinaţi; prin această metodă, la două luni după termoterapie,
aproape toate clonele induse în experiment au fost libere de virus.

Substanţe viricide folosite în vederea diminuării infecţiilor virale
Se apreciază că, indiferent de metoda utilizată în eradicarea virusurilor, în unele cazuri la anumite viroze şi în special la atacul cu viroizi (particule care pot strabate până la meristem, fiind rezistente la caldură) este necesară administrarea de substanţe în mediul de cultură, cu rol de a diminua infecţia. Toussaint (1985) propune o listă amplă cu substanţe vericide, de tipul compuşilor antimetabolici, printre care se numără şi ribavirina. Această substanţă are rolul de a inhiba numeroase procese biochimice, conducând la blocarea sintezei şi a translocarii particulelor virale.
Ribavirina poate deveni toxică dacă depăşeşte 35 ppm în mediul de cultură şi dacă se administrează mai mult de două subculturi. Deogratis (1987) demonstrează că pentru o eliminare completă şi definitivă de virusuri cu ajutorul ribavirinei (virozele) este obligatorie prezenţa în mediul de cultură a unei citochinine, care să stimuleze multiplicarea rapidă a materialului biologic. De asemenea, acelaşi autor remarca o corelaţie directă între tratamentul cu ribavirină şi genotipul studiat, rezultatele fiind diferite de la un soi la altul. Rezultatele cercetărilor întreprinse în scopul eliminării closterovirusurilor la viţa-de-vie cu ajutorul ribavirinei au fost controversate. Astfel, Shauter (1982) afirma că s-au obţinut procente bune prin aplicarea în mediul de cultură a substanţelor viricide, în timp ce Staudt şi Kassemreyer (1994) nu au observat efecte asemănătoare.

Victor VĂTĂMANU
_